Prinsip yang digunakan dalam metode MPN

MPN adalah suatu metode enumerasi mikroorganisme yang menggunakan data dari hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair spesifik dalam seri tabung yang ditanam dari sampel padat atau cair yang ditanam berdasarkan jumlah sampel atau diencerkan menurut tingkat seri tabungnya sehingga dihasilkan kisaran jumlah mikroorganisme yang diuji dalam nilai MPN/satuan volume atau massa sampel.

Contoh :

Data yang didapat adalah : 3 tabung positif dari pengenceran 1/10, 2 tabung positif dari pengenceran 1/100 dan 1 tabung positif dari pengenceran 1/1000.

Lalu dicocokkan dengan tabel, menghasilkan nilai : 150 MPN/g

Prinsip utama metode ini adalah mengencerkan sampel sampai tingkat tertentu sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang pas/sesuai dan jika ditanam dalam tabung menghasilkaan frekensi pertumbuhan tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak selalu”. Semakin besar jumlah sampel yang dimasukkan (semakin rendah pengenceran yang dilakukan) maka semakin “sering” tabung positif yang muncul. Semakin kecil jumlah sampel yang dimasukkan (semakin tinggi pengenceran yang dilakukan) maka semakin “jarang” tabung positif yang muncul. Jumlah sampel/pengenceran yang baik adalah yang menghasilkan tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak selalu”. Semua tabung positif yang dihasilkan sangat tergantung dengan probabilitas sel yang terambil oleh pipet saat memasukkannya ke dalam media. Oleh karena itu homogenisasi sangat mempengaruhi metode ini. Frekuensi positif (ya) atau negatif (tidak) ini menggambarkan konsentrasi mikroorganisme pada sampel sebelum diencerkan.

Asumsi yang diterapkan dalam metode MPN adalah :

-   bakteri terdistribusi sempurna dalam sampel

-   sel bakteri terpisah-pisah secara individual, tidak dalam bentuk rantai atau kumpulan (bakteri coliform termasuk E. coli terpisah sempurna tiap selnya dan tidak membentuk rantai).

-   media yang dipilih telah sesuai untuk pertumbuhan bakteri target dalam suhu dan waktu inkubasi tertentu sehingga minimal satu sel hidup mampu menghasilkan tabung positif selama masa inkubasi tersebut.

-   jumlah yang didapatkan menggambarkan bakteri yang hidup (viable) saja. Sel yang terluka dan tidak mampu menghasilkan tabung positif tidak akan terdeteksi.

MPN dinilai dari perkiraan unit tumbuh (Growth Unit / GU) seperti CFU, bukan dari sel individu. Meskipun begitu baik nilai CFU atau MPN dapat menggambarkan seberapa banyak sel individu yang tersebar dalam sampel. Metode MPN dirancang dan lebih cocok untuk diterapkan pada sampel yang memiliki konsentrasi <100/g atau ml. Oleh karena itu nilai MPN dari sampel yang memiliki populasi mikroorganisme yang tinggi umumnya tidak begitu menggambarkan jumlah mikroorganisme yang sebenarnya. Jika jumlah kombinasi tabung positif tidak sesuai dengan tabel maka sampel harus diuji ulang. Semakin banyak seri tabung maka semakin tinggi akurasinya tetapi juga akan mempertinggi biaya analisa.

Pemilihan media sangat berpengaruh terhadap metode MPN yang dilakukan. Umumnya media yang digunakan mengandung bahan nutrisi khusus untuk pertumbuhan bakteri tertentu. Misalnya dalam mendeteksi kelompok coliform dapat menggunakan media Brilliant Green Lactose 2% Bile (BGLB) broth. Di dalam media ini mengandung lactose dan garam empedu (bile salt) yang hanya mengizinkan coliform  untuk tumbuh. Jika terdapat ketidaksesuaian jenis media dan bakteri yang diinginkan maka metode MPN akan menghitung bukan bakteri yang dituju. Untuk menghitung coliform dapat menggunakan Lauryl Sulphate Tryptose (LST) broth, sedangkan untuk menghitung E.coli diperlukan media EC (Escherichia coli) broth.  Berdasarkan prinsip diatas apakah mungkin metode MPN dapat untuk menghitung jenis bakteri selain jenis-jenis coliform ?

Jadi nilai MPN adalah suatu angka yang menggambarkan hasil yang PALING MUNGKIN.

Aspek peluang dalam metode MPN

Berdasarkan prinsip diatas maka “seharusnya/sebaiknya” jumlah tabung positif pada pengenceran 1/10 > 1/100 > 1/1000 (misalnya 5-3-1) karena setiap pengenceraan mengurangi jumlah mikroorgansime target dan akibatnya semakin kecil kesempatannya untuk membuat tabung menjadi positif. Namun seringkali hasil yang didapat tidak sesuai dengan logika peluang, seperti 5-3-4 yang menghasilkan nilai 210 (lihat tabel dibawah). Bisa saja banyak sel tidak sengaja terambil dan memperbanyak pengenceran selanjutnya atau homogenisasi tidak berlangsung sempurna.

Untuk memahami peranan peluang dalam mendistribusikan sel sehingga menghasilkan tabung positif maka jumlah tabung positif (digaris bawah) pada tabel dicoba untuk dirunut dan diilustrasikan kembali dalam proses penanamannya pada gambar berikut (dianggap bahwa nilai MPN/ml sama dengan sel/ml). Namun perlu diingat, jumlah sel yang terambil tidak selalu seperti itu, semuanya adalah peluang dan angka yang didapat adalah angka paling mungkin.

Perbandingannya dengan plate count

Telah disebutkan diatas bahwa MPN cocok untuk sampel dengan konsentrasi mikroorganisme rendah khususnya dari jenis sampel air, susu, atau makanan terutama yang memiliki partikel-partikel yang larut didalamnya. Partikel-partikel tersebut dimungkinkan mampu mempengaruhi keakuratan perhitungan bakteri jika menggunakan metode penanaman pada cawan petri. Hal ini karena sel bakteri yang terpisah dapat mengelompok pada partikel makanan dan mungkin tidak terpisah pada proses homogenisasi dalam pengenceran bertingkat sehingga saat diplating satu kumpulan tersebut menjadi satu koloni dan membuat data plate count menjadi bias. Metode MPN dapat mengeliminasi kekurangan ini.